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    FDBA法

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    服务概述

    经典的ＦＤＮＢ法是Ｎ 末 端氨基酸的分析方法，是蛋白质化学中最重要的方法之一，可用于测定蛋白质或 肽的Ｎ末端基团、蛋白质中肽链的数目、蛋白质的最小分子量及蛋白质水解产 物的氨基酸组成。

    ＦＤＮＢ法的反应原理如图１所示。２，４-二硝基氟苯（ＦＤＮＢ）在很温和的 条件下（室温，ｐＨ＝８～９），能与蛋白质的游离氨基反应，生成二硝基氟苯衍生 物———ＤＮＰ蛋白。ＤＮＰ蛋白完全水解释放出Ｎ末端的ＤＮＰ-氨基酸，顺利获得色谱 分离后与标准ＤＮＰ氨基酸对照进行鉴定。

    蛋白质测定

    图1 ＦＤＮＢ法的反应原理

    ＦＤＮＢ的反应性很强，能在不引起肽链断裂的温和条件下，定量与蛋白质反 应，因而在测定过程中不会因肽链断裂而人为形成“新”末端。除了某些链内氨 基酸衍生物外，ＤＮＰ-氨基酸都呈黄色，非常有利于检测。

    虽然ＦＤＮＢ也能与α-氨基外的其他少数基团反应，但生成物并不影响Ｎ端 氨基酸的分析，如ｏ-ＤＮＰ酪氨酸（无色）、ｉｍ-ＤＮＰ组氨酸（无色）、ε-ＤＮＰ赖 氨酸（黄色，醚不溶），因而ＦＤＮＢ是一个理想的端基分析试剂。

    ＤＮＢ法的具体分析过程如下：

    ① 蛋白质的二硝基苯化　反应在微碱性介质中进行，在ＮａＨＣＯ３ 存在下，暗室中反应，反应时间主要取决于蛋白质样品的溶解度和反应性。

    ② 除去过量试剂　反应结束后酸化处理，离心，并用醇、醚洗涤，ＤＮＰ蛋 白质避光储存。

    ③ ＤＮＰ-蛋白质的水解　用盐酸水解时，大部分ＤＮＰ-氨基酸不会被破坏 （表１）。

    ④ 分离ＤＮＰ-氨基酸　根据各自的溶解度以有机溶剂乙醚从水解产物中 提取。

    表１　酸水解时的ＤＮＰ-氨基酸的回收率
    ＤＮＰ-氨基 ５.７ｍｏｌ／Ｌ盐酸水解 １２ｍｏｌ／Ｌ盐酸１０５℃水解１６ｈ
    回收率／％
    水解时间／ｈ 回收率／％
    DNP-Ala
    DNP-Arg
    DNP-Asp
    双-DNP-Cys
    DNP-Glu
    DNP-Gly
    DNP-Ile
    DNP-Leu
    双-DNP-Lys
    ε-DNP-Lys
    DNP-Met
    DNP- Phe
    DNP-Pro
    DNP- Ser
    DNP-The
    DNP- Trp
    双-DNP-Tyr
    DNP-Val    		 12
    24
    12
    12
    8
    12
    12
    8
    12
    12
    12
    12
    24
    12
    12
    12    		 80
    90
    60
    25
    75
    40
    80
    80
    95
    95
    70
    10
    90
    90
    90
    75
    80    		 75
    75
    75
    75
    50
    75
    75
    75
    75
    75
    50
    50
    75
    75
    50
    75

    ⑤ ＤＮＰ-氨基酸的分析　采用单相或双相纸色谱、硅胶薄板色谱，与标准 ＤＮＰ氨基酸对照进行定量分析。

    用ＦＤＮＢ法鉴定出α-Ｎ-ＤＮＰ-氨基酸，并确定Ｎ末端氨基酸的数目，从而计 算出多肽链的数目。但在有些情况下，会检测不到末端基团：末端封闭，无游离 α-氨基的环状化合物；末端乙酰化；ＤＮＰ-氨基酸被分解，如ＤＮＰ-Ｐｒｏ、ＤＮＰ- Ｇｌｙ；酸解未形成ＤＮＰ-氨基酸，如末端为Ｖａｌ、Ｉｌｅ时，水解生成ＤＮＰ-小肽。

    在ＦＤＮＢ法中，由于ＤＮＰ-氨基酸对光敏感，实验必须避光在暗处进行。此 外，酸水解ＤＮＰ-蛋白质取得氨基酸和ＤＮＰ-氨基酸的混合物，必须反复抽提来 分离。因此，作为端基分析的经典方法，ＦＤＮＢ法近年来逐步被操作更简单、灵 敏度更高的ＤＮＳ法代替。

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