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    酵母质粒抽提

    实验原理：

    裂解法抽提酵母质粒。

    实验目的：

    从酵母菌体中抽提酵母质粒，可用于转化大肠杆菌，便于后续测序验证等实验的召开。

    试剂：

    2×YPAD 液体培养基 配方如下： Yeast lysis solution(YLS) 配方如下：
    Yeast extract 4g (OXOID,LP0021) 2% (体积比) Triton X-100
    Glucose H2O 8.8g (国药集团化学试剂有限公司，10010518) 1% (质量体积比) SDS (上海生工，SB0485)
    Peptone 8g (OXOID,LP0042) 100mM NaCL (上海生工，SB0476)
    Adenie sulfate 20mg (上海生工，0183) 1mM EDTA (国药集团化学试剂有限公司，10009717)
    加ddH2O至200mL。
    注：培养基灭菌前呈亮黄色，灭菌后呈葡萄糖酒红色。    		 例如：
    Triton X-100 2mL
    SDS 1g
    NaCl 0.585g
    EDTA(0.5M) 0.2mL
    加ddH2O至100mL。
    注：Triton X-100非常粘稠，吸取时需用剪过的枪头吸，枪头需在液面处停留较长时间待吸取充分后再取出。
    3.25:24:1 （苯酚：三氯甲烷：异戊醇体积比）：上海生工，pH=8.0 4.95%乙醇 （国药试剂，分析纯） 5.3M NaAc （国药试剂，分析纯，pH=5.2） 6.75%乙醇 （由95%乙醇稀释）

    仪器：

    1.30℃恒温摇床。

    2.移液器：1mL、200uL、10uL、2.5uL

    3.枪头及配套枪头套：1mL、200uL、20uL

    4.EP管和配套管架：1.5mL

    5.4℃冷冻离心机

    操作步骤：

    1.挑取酵母单菌落接种于4mL 2xYPAD 液体培养基中，30℃ 220 rpm摇床培养约18h。

    2.将培养好的菌液倒入1.5mL离心管中，室温（25℃）1000g离心10sec收集菌体（约100uL）。

    3.向菌体沉淀中加入200uL YLP (Yeast lysis solution),加入牙签，在振荡器上涡旋打散混匀菌体。

    4.向管中加入200uL苯酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒摇晃5min，室温13000rpm离心5min。

    5.小心吸取上清转移至新离心管中。

    6.重复步骤4和步骤5。

    7.向管中加入500uL 95%乙醇和20uL 3M NaAc(pH=5.2)，颠倒混匀。4℃ 10000g 冷冻离心10-30min。

    8.向管中加入750uL 75%乙醇浸洗沉淀，室温10000g 离心 5-10min。

    9.重复步骤8。

    10.小心弃上清，将离心管置于超净工作台上吹干沉淀，加入10uL ddH2O或TE熔解酵母质粒。

    注意事项：

    1.此方法抽提得到的酵母质粒可用于电转大肠杆菌。

    2.酵母质粒拷贝数低，浓度低，所以需多取一些（1-2uL）电转大肠杆菌感受态细胞。

    3.酵母质粒电转效率较低，所以加LB复苏后的菌液需全部涂LA平板。

    4.电转大肠杆菌质粒时需用转化效率较高的感受态细胞。






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