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哺乳动物稳定细胞株筛选

哺乳动物稳定细胞系（stable cell line）是指使用外源目的基因整合到染色体上的稳定表达的细胞，顺利获得外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代，可以稳定表达目的基因的细胞系（cell line）。

相对于瞬时转染来说，稳转转染细胞是将携带了目的基因、组成型启动子、抗性基因、筛选标记、表达增强子等一系列元件的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的蛋白。建立稳定的细胞系，是指对靶细胞进行筛选，根据不同表达载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，或者是利用基因缺陷的原理进行筛选，最终取得稳定传代的细胞株。

稳定细胞株筛选服务作为z6com人生就是博生物的传统优势项目，无论是技术标准，还是细胞培养的硬件环境，我们始终保持行业内的顶尖水平。
1、我们技术方向聚焦于高表达稳定细胞株的筛选，可为工业用户和科研用户给予筛选服务。
2、我们现在主要给予基于CHO细胞和293细胞的筛选服务，可选择G418/潮霉素/嘌呤霉素筛选系统的稳转细胞系筛选服务。
3、基于客户的要求和经费预算，可分别给予多克隆稳定细胞株以及单克隆稳定细胞株。
4、严格的交付标准，10代稳定性测序、单克隆批培养、支原体检测等，解决交付稳定细胞株产品的后顾之忧。
5、同时我们还给予细胞库检测与病毒灭活/清除验证等生物制品安全性评价服务，对接国内外法规要求

z6com人生就是博生物哺乳动物稳定细胞株筛选服务程序

一、载体构建

载体构建服务
载体构建工作	周期	交付材料
A、 密码子优化&基因合成	1~2周	酶切/测序验证报告
B、 亚克隆&质粒制备	1~2周	含克隆质粒的DH10、供体质粒2-4ug
为保护z6com人生就是博技术机密，z6com人生就是博无法给予表达载体质粒，仅给予包含目的基因的克隆质粒。

 

二、表达鉴定及纯化小试

表达鉴定及纯化小试服务
表达鉴定及纯化小试	周期	交付材料
A、 尝试不同的表达培养基	1周	表达优化结果
B、 尝试不同的转染方式
C、最优的条件表达200ml小试	2周	纯化小试得率结果

 

三、稳定细胞系构建

稳转细胞系筛选操作流程
项目	服务内容	服务周期	交付材料
转染	药物浓度摸索、药筛、多克隆鉴定	3周	多克隆鉴定结果
单克隆	挑选表达较好的多克隆3个分别亚克隆，及单克隆生长、单克隆鉴定	3周	单克隆鉴定结果
加压&二检	挑选单克隆最好的20株扩大，进行复检，挑取表达最好的8株	2-3周	二检结果
加压&三检	二检8株细胞扩大，进行复检，挑取最好的3株	2-3周	三检结果
表达评估	稳定性评估（表达量稳定性&细胞增殖及活力稳定性）、批次表达实验、纯化小试	4周	表达量评估结果、稳定性评估结果
建立细胞库	支原体检测、细胞冻存	1-2周	支原体检测结果、细胞株

 

筛选稳定细胞系实验案例数据：

稳定性测试
①相同密度的细胞接种到6孔板，每隔48小时，取样计数，按照相同的密度继续接种，最后进行ELISA或WB检测，确认细胞目的蛋白表达的稳定性。
②稳定性测试进行10代。

单克隆批培养
相同密度的细胞接种到摇瓶，每天取样计数，进行ELISA检测，确认生长和表达曲线（3.0 x 10^5 cells/ml seeded in 125ml shaker flask to confirm the growth file and expression titer） 。

支原体检测

染色法（Hoechst staining）

PCR 方法

建库
•根据所有克隆株的确认和冻存的结果，挑选最优的克隆进行冻存建库
•冻存培养基（Freezing medium）: 10% DMSO
•冻存密度（Freezing density）:> 0.5 x 107 cells/vial

稳定细胞株的应用：

①研究级别的稳定细胞系
·主要的目标蛋白：跨膜蛋白，离子通道，酶等；
·主要用途是基于细胞的测试；
·其他蛋白功能的研究；
②生产、工业级别的稳定细胞系
·主要用于重组蛋白/抗体的大规模生产
·顺利获得基因扩增技术，可以取得高表达的稳定细胞株

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